急性脑梗死和Alzheimer病脑脊液高 [复制链接]

急性脑梗死和Alzheimer病脑脊液高水平髓鞘素抗原B细胞免疫应答

急性脑梗死和Alzheimer病脑脊液高水平髓鞘素抗原B细胞免疫应答

急性脑梗死和Alzheimer病脑脊液高水平髓鞘素抗原B细胞免疫应答

中风与神经疾病杂志 1999年第2期第16卷 论著与经验总结

作者：王维治　王化冰　黄煜敏

单位：150086　哈尔滨医科大学附属第二医院神经科

关键词：B细胞；酶联免疫斑点技术；髓鞘素碱性蛋白；髓鞘素结合糖蛋白；含脂质蛋白；脑脊液

摘　要　目的　确认急性脑梗死(ACI)和Alzheimer病(AD)对髓鞘素碱性蛋白(MBP)、髓鞘素结合糖蛋白(MAG)和含脂质蛋白(PLP)的B细胞免疫应答。方法　采用酶联免疫斑点技术检测了ACI、临床可能AD和其它神经疾病(OND)对照组患者外周血和脑脊液(CSF)中MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞。结果　ACI、AD和OND患者外周血中均可检出IgG、IgA、IgM三种表型MBP、MAG、PLP抗体分泌细胞，无显著差异。但ACI和AD患者CSF中IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞均呈显著性增高。结论　ACI急性脑缺血损伤和AD神经变性可能导致体内B细胞激活及CNS内髓鞘素反应性B细胞免疫应答，其病理意义有待探讨。

High level of B cell responses to myelin antigens occurs in

cerebrospinal fluid on acute cerebral infarcts and Alzheimer,s disease.

Wang Weizhi,Wang Huabing,Huang Yumin.

Department of Neurology,The Second Clinical Medical

College,Habrin Medical University,Harbin 150086.

Abstract　Objective　To demonstrate whether B cell responses to myelin antigens involve in acute cerebral infarcts (ACI) and Alzheimer,s disease (AD).Methods　Using enzyme linked immunospot (ELISPOT) assays,we examined numbers of cells in peripheral blood and cerebrospinal fluid (CSF) secreting antibodies to myelin basic protein (MBP),myelin associated glycoprotein (MAG) and myelin proteolipid protein (PLP) in ACI patients (within 4 weeks after onset) and in AD patients and for comparison,in patients with other neurological diseases (OND).Results　Cells secreting antibodies to MBP,MAG and PLP of IgG,IgA and IgM isotypes were detected in peripheral blood from patients with CVD,AD and ere were no differences between the 3  contrast,CSF from patients with ACI or AD contained elevated numbers of cells secreting IgG antibodies to MBP,MAG and nclusions　The findings suggest that the brain damage associated with acute ischemia in ACI and neurodegeneration in AD lead to in vivo strong B cell activation and responses to myelin antigens within the central nervous e role of such B cell autoreactivities in ACI and AD remains to be settled.

Key words　B cells　ELISPOT　Myelin basic protein　Antimyelin　antibodies　Cerebrospinal fluid

大量研究已证明急性脑梗死(ACI)患者可发生中枢神经系统(CNS)免疫反应，如ACI发病1～30d脑梗死区单个核细胞(MNC)数呈持续增多，脑脊液(CSF)中MNC数也增加。约10%ACI患者可检出CSF寡克隆区带(oligoclonal bands,OB)而血清中缺如［1］。我们发现16%AIC患者CSF～IgG指数增高［2］，均指示IgG鞘内合成。但对髓鞘素抗体的研究迄今未见报告。Alzheimer病(AD)也有脑反应抗体(BRAs)、神经原纤维缠结(NFT)蛋白抗体、人脑S100蛋白或神经元特异性烯醇化酶抗体、β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein)抗体［3］和髓鞘素碱性蛋白(MBP)抗体［4］等异常B细胞反应。我们用酶免疫斑点(ELISPOT)技术评价了ACI、临床可能AD和其它神经疾病(OND)患者外周血及CSF-MBP、髓鞘素结合糖蛋白(MAG)和含脂质蛋白(PLP)的B细胞免疫应答。

1　对象和方法

1.1　检查对象　(1)ACI组：颈内动脉系ACI患者44例，除外腔隙性梗塞。男32例，女12例，年龄37～89岁，平均68岁。诊断符合全国第4届脑血管病会议制定的标准，并经CT证实。发病4周内采外周血(PB)和CSF，CSF-MNC增多(＞5×106／L)3例，寡克隆带阳性3例，IgG指数增高(＞0.70)2例。反映血脑屏障(BBB)损伤［2］的CSF与血清白蛋白比值(CSF-Alb/S-Alb)增高9例。(2)临床可能AD组：患者17例，男8例，女9例，年龄52～84岁，平均69岁。本组患者符合可能AD的诊断标准［5］，简易精神状态检查(MMSE)评分为10～23分，改良Hachinski缺血量表≤4分。凡当前用药可能影响患者的认知功能和抑郁症、多梗塞性痴呆等均予除外。CSF细胞数、CSF-Alb/S-Alb比值和IgG指数均正常，但4例患者CSF和血清均出现寡克隆带。(3)OND组：患者26例，男11例，女15例，年龄44～77岁，平均60岁。包括紧张型头痛13例，偏侧面肌痉挛5例，脊柱骨关节性脊髓病4例，多发性神经病、单发性神经病、三叉神经痛及核上性眼肌麻痹各1例。CSF细胞数、CSF-Alb/S-Alb比值和IgG指数均正常，无寡克隆带。18例同时检查了CSF，但细胞数仅能查1～2种抗体分泌细胞。

1.2　CSF和PB和MNC分离　腰穿采集CSF15～20ml置于无菌硅化试管中，200g离心10min，分离的MNC再以Iscove改良的Dulbecco培养液(Flow Laboratories,UK)洗涤后离心，用200μl加有2mmol L-谷氨酰胺、抗生素、10%(v/v)胎牛血清(FCS，Gibco,UK)的Iscove培养液重悬，将MNC数调至(5～10)×104细胞/ml。PB同时采集于肝素化玻璃试管，用淋巴细胞分层液(Lymphoprep;Norway)经密度梯度离心分离MNC，洗涤后在加有L-谷氨酰胺、抗生素和FCS培养液中调整MNC数至1×106细胞/ml。

1.3　抗原制备　MBP、PLP和MAG均从正常人脑髓鞘素中提取。MBP纯度经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，在24kDa处显示单一条带。PLP纯化亦经SDS-PAGE，并用Western印迹法和大鼠抗MBP多克隆抗血清验证毫不混杂MBP。MAG提取物再经琼脂糖CL-6B柱(Pharmacia,Sweden)提纯，经SDS-PAGE验证在100kDa有单一条带，用结合于100kDa的MAG IgM抗体阳性患者血清经Western印迹证实。

1.4　ELISPOT法计数MBP、PLP和MAG抗体分泌细胞　用96孔硝酸纤维膜微量板(Millipore Co,U.S.)每孔包被100μl浓度为10μg/ml的MBP、MAG或PLP抗原4℃过夜，洗板后用未灭活5%FCS封闭纤维膜上未与抗原结合的剩余位点，每孔加入100μl含1×105PB MNC或含(5～10)×103 CSF～MNC,PB取双份检测。微量板置于37℃、7%CO2孵箱中孵育过夜后洗板，再将1/500稀释生物素化山羊抗人IgG、IgA和IgM(Sigma,U.S.)；加入适当的孔中。室温孵育4h，洗板后与稀释的亲合素-生物素过氧化物酶复合物(ABC Vectastain Elite Kit U.S.)室温孵育1h，洗板后加底物3-氨基9-乙基卡巴唑(3-amino-9-ethylcarbazole,Sigma)和H2O2，显示出红褐色斑点后用流水洗板终止反应。每个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞，由不了解被检对象临床诊断的专人在解剖显微镜下读板。斑点形成可被具有抑制分泌作用的莫能菌素(monensin)所抑制，也可被放线菌酮(cycloheximide)促进合成，证明形成的斑点是抗体主动分泌的结果，而非嗜细胞性抗体的脱落。结果以每105MNC的斑点数表示。双份孔间的变异通常＜10%。

实验数据用Mann-Whitney,s U-test处理。

2　结　果

2.1　外周血IgG、IgA和IgM表型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞　大多数ACI患者PB中有MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞，以IgG表型为主。该型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞均值分别为3、2.2和2.9/105 PB-MNC，平均每33000、46000和35000 MNC即有1个抗体分泌细胞。21例ACI患者同时检测PB-MBP、MAG和PLP的IgG型抗体分泌细胞，7例(33%)有此3种、9例(43%)有两种、3例(14%)有一处抗体分泌细胞，2例(10%)全无(见表1)。

表1　ACI、AD和OND组外周血MBP、MAG和PLP

抗体分泌细胞反应患者数(百分比)

患者组

抗体分泌细胞反应患者数(%)

对3种抗原

对2种抗原

对1种抗原

无反应

ACI(例数=21)

AD(例数=7)

OND(例数=11)

7(33)

1(14)

4(36)

9(43)

3(43)

4(36)

3(14)

1(14)

1(9)

2(10)

2(29)

2(18)

注：对2种抗原指MBP和MAG或MBP和PLP

AD患者PB也可检出IgG、IgA和IgM 3种表型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞，数目和出现频率与ACI相似，与ACI组无显著性差异。7例AD患者同时检测了PB-MBP、MAG和PLP的IgG型抗体分泌细胞，1例有3种、3例有2种、1例有1种抗体分泌细胞，2例均无反应(表1)。IgA和IgM表型的MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞也见于ACI或AD外周血中，但数目更少，频率更低。OND组PB中3种表型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞均值呈普遍较低趋势，但与ACI和AD组无显著性差异。

2.2　脑脊液IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞　ACI患者CSF中IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞中位数水平较OND组显著增高(分别P＜0.05,P＜0.01和P＜0.01)(表2)，分别约为PB的80、150和130倍。20例ACI患者同时检测2～3种髓鞘素IgG抗体分泌细胞，同时检测此3种IgG型抗体分泌细胞的2例，有1例3种均阳性，另1例仅MBP抗体分泌细胞阳性；其余18例中有14例的两种随机检查的髓鞘素IgG抗体分泌细胞均呈阳性，2例对其中一种呈阳性反应，2例均阴性(见表3)。

表2　ACI、AD和OND患者IgG表型MBP、MAG

和PLP抗体分泌细胞数

患者组

IgG抗体分泌细胞(105CSF-MNC)

抗MBP

抗-MAG

抗PLP

ACI

AD

OND

P值

范围

均数(标准差)

中位数

阳性例数/检查例数

范围

均数(标准差)

中位数

阳性例数/检查例数

范围

均数(标准差)

中位数

阳性例数/检查例数

ACI和OND

AD和OND

ACI和AD

239(398)

75

17/21

294(422)

40

4/7

40(70)

0

4/9

＜0.05

＜0.05

＞0.05

329(542)

91

19/24

669(1075)

125

4/8

19(30)

0

3/9

＜0.01

＜0.05

＞0.05

373(542)

100

16/18

380(684)

80

4/5

33(59)

0

3/9

＜0.01

＜0.05

＞0.05

表3　20例ACI患者检测的CSF3或2种髓鞘素组分

IgG抗体分泌细胞反应类型

抗体分泌细胞

检查患者数

B细胞反应类型

阳性患者

MBP+MAG+PLP

MBP+MAG

MBP+PLP

MAG+PLP

2

12

1

5

3种(+)

MBP(+)；MBG和PLP(-)

2种(+)

MBP(+)；MAG(-)

2种(-)

2种(+)

2种(+)

1

1

8

2

2

1

5

AD患者CSF中IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞的分布范围、均值和中位数值与ACI相似，中位数水平较OND组显著增高(P＜0.05)(表2)。AD组CSF这3种抗体分泌细胞约为PB的140、240和190倍，而OND组CSF相应细胞数仅为PB的18、12和25倍。

3　讨　论

ELISPOT法是检测不同特异性及表型抗体分泌细胞的高敏感技术。本研究显示ACI的CSF-MBP、-MAG和-PLP抗体分泌细胞呈显著增高趋势，提示CNS存在对髓鞘素组分的B细胞免疫应答。近年来大量研究强调，炎症反应是缺血性脑损伤病理生理的组成部分。卒中实验动物模型已证明大脑中动脉闭塞，发生脑缺血性损伤数小时即有嗜中性粒细胞和T淋巴细胞聚集于病灶附近。采用99mTc HMPAO标记白细胞的SPECT监测脑卒中后炎性过程，发现急性半球缺血性卒中病灶区可发生白细胞浸润，持续5周方渐消退。卒中后24h～2d，CSF中促炎症性细胞因子(proinflammatory cytokine)如IL-1β、IL-6、IL-8和粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)等增高［6］。卒中动物模型应用免疫抑制性转移生长因子-β(TGF-β)的治疗试验，显示可减少梗塞面积［7］。

AD通常被认为是一种非常复杂的异质性疾病。环境的(病毒、微生物和铝)、生化的(牛磺酸蛋白、β-淀粉样蛋白、嗜神经因子、神经递质和神经肽)、遗传的(1、6、14、19和21对染色体上基因)和炎症性因子包括抗体反应和细胞介导的自身免疫机制均影响AD［8］。本研究证明AD患者CSF中IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞中位数水平较OND显著增高。通常认为AD的BBB遭受破坏［8］，但本组AD患者CSF-Alb/S-Alb比值正常，指示其BBB功能正常。

我们曾报告ACI及AD患者外周血体外培养时用MBP和PLP刺激MNC，可检出高水平γ-干扰素(IFN-γ)分泌性T细胞，且CSF中数量更多［9，10］。IFN-γ是主要由1型辅助性T细胞(Th1)和巨噬细胞分泌的促炎症性细胞因子，其多效性作用包括促使B细胞成熟和抗体产生。本文结果提示ACI和AD均有局限于CSF封闭空间的高水平MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞反应，主要为IgG表型。说明ACI和AD对多种髓鞘素抗原的B和T细胞免疫应答均呈一致性上调趋势，但其病理意义尚有待进一步探讨。

本课题为国家自然科学基金资助项目(No.)

参考文献

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9 Wang WZ,Olsson T,Kostulas V,et elin antigen reactive T cells in cerebrovascular in Exp Immunol,1992,88:157.

10 王维治，肖保国,Link zheimer型痴呆的髓鞘素蛋白自身应答性T细胞免疫反应.中华神经科杂志，1996，29：151.

(收稿　修回)